Ácidos nucleicos.


Introducción.

El ADN es sin duda la molécula más importante que conocemos. Esta en toda forma de vida, como las bacterias, los hongos, las plantas y los animales, almacena la información hereditaria. Ninguna otra molécula ha atrapado tanto la imaginación del público en general como el ADN. Se ha convertido en el icono de la ciencia de la vida ,  en 1953 se descubrio su estructura de doble hélice, Jim Watson y Francis Crick, están entre los más famosos de los científicos. Sin embargo, pocas personas han oído hablar de Johann Friedrich Miescher, el hombre que descubrió el ADN y pocos conocen la historia de cómo descubrió la molécula de la vida.

Friedrich Miescher y el descubrimiento del ADN.

 

En los últimos 60 años, el ADN ha pasado de ser una molécula oscura con presumidas funciones accesorias o estructurales dentro del núcleo hasta el icono de la biociencia moderna. La historia del ADN a menudo parece comenzar en 1944 con Avery, MacLeod y McCarty demostrando que el ADN es el material hereditario. En 10 años de sus experimentos, Watson y Crick descifraron su estructura y en otra década en el código genético se descifró. Sin embargo, la historia del ADN ya habia comenzado en 1869, con el joven médico suizo Friedrich Miescher. Acabado de terminar su educación como médico, Miescher se trasladó a Tübingen para trabajar en el laboratorio del bioquímico Hoppe-Seyler, su objetivo era elucidar los bloques de construcción de la vida y eligio los leucocitos como punto de partida. 

Los leucocitos o glóbulos blancos, son un conjunto heterogéneo, que significa de algo que está compuesto de elementos o partes de distinta naturaleza, de células sanguíneas que son ejecutoras de la respuesta inmunitaria, interviniendo así en la defensa del organismo contra sustancias extrañas o agentes infecciosos, llamados antígenos.

Inicialmente, Miescher trató de aislar las células de sus experimentos de los ganglios linfáticos, pero era difícil purificar los linfocitos e imposible obtener suficientes cantidades para el análisis . Miescher cambió a examinar leucocitos y obtuvo las células para sus experimentos del pus en vendas quirúrgicas frescas, que él recogió de la clínica quirúrgica cercana en Tübingen. En el pus, encontró el material base ideal para sus análisis y su pureza histológica, esto le permitió lograr la más completa purificación de los bloques químicos que constituyen las células .

En un principio, Miescher se centró en los diversos tipos de proteínas que componen los leucocitos, ya que las proteínas se consideraron los objetivos más prometedores para la comprensión de cómo funcionan las células. Miescher demostró que las proteínas y los lípidos eran los principales componentes del citoplasma de las células, describía sus propiedades con cierto detalle y trataba de clasificarlas, sin embargo, su trabajo se vio obstaculizado por los simples protocolos y equipos a su disposición y la diversidad de proteínas dentro de las células superó sus métodos analíticos.

Sin embargo, durante estos ensayos, Miescher observó que una sustancia precipitó de la solución cuando se añadió ácido y se disolvió de nuevo cuando se añadió álcali. Había, por primera vez, obtenido un precipitado bruto de ADN.

Miescher declaró que de acuerdo con los hechos histoquímicos conocidos, tuvo que atribuir tal material a los núcleos y decidió examinar más detenidamente los núcleos de las células, una parte de la célula sobre la cual muy poco se conocía en ese momento.

Al darse cuenta de una significación potencial, escribió: "Un material compuesto sólo de células, como éste, finalmente requeriría  un estudio serio de la constitución química del núcleo de la célula" . Sin embargo, Miescher todavía necesitaba separar la sustancia nueva de las proteínas en sus extractos celulares para poder analizarla mejor. De este modo tuvo que desarrollar nuevos protocolos para separar primero los núcleos de las células del citoplasma y luego aislar el precipitado enigmático .

Antes de intentar el aislamiento de las células del pus en vendas quirúrgicas, Miescher tomó gran cuidado para asegurarse de que su material de origen era fresco y no contaminado. Lo examinó minuciosamente y descartó todo lo que mostraba signos de descomposición, ya sea en términos de olor, apariencia bajo el microscopio, o por haberse vuelto ácida. Una gran parte del material que pudo obtener no cumplió con estos requisitos estrictos. Las muestras que se hizo se utilizaron posteriormente para aislar leucocitos.

En un primer paso, Miescher separó los leucocitos del material de vendaje y del suero . Esta separación planteó un problema para Miescher. Soluciones de NaCl o una variedad de soluciones de sales alcalinas o alcalinotérreas usadas para lavar el pus dieron como resultado un "hinchamiento viscoso" de las células, que era imposible de procesar . Esta "hinchazón viscosa" de las células era presumiblemente debido al ADN de alto peso molecular, que se había extraído de las células que habían sido dañadas. Sólo cuando Miescher probó una solución diluida de sulfato de sodio, la solución de sal (Na2SO4 · 10 H2O) y nueve partes de agua, para lavar las vendas logró aislar con éxito leucocitos distintos, que se podían filtrar a través de una hoja para eliminar las fibras de algodón del vendaje. Miescher dejó subsiguientemente la solución de lavado durante 1a 2 horas, para permitir que las células que sedimentaran se  puedan inspeccionar microscópicamente, para ver  los leucocitos y para confirmar que no mostraban ningún signo de daño.

Habiendo aislado las células, Miescher tuvo que separar los núcleos del citoplasma. Esto nunca se había logrado antes y Miescher tuvo que desarrollar nuevos metodos. Lavó las células enjuagándolas varias veces con soluciones frescas de ácido clorhídrico diluido (1: 1000) durante un período de varias semanas a "temperaturas invernales" (que eran importantes para evitar la degradación). Este procedimiento eliminó la mayoría del "protoplasma" de las células, dejando atrás los núcleos. El residuo de este tratamiento consistió en parte de núcleos aislados y de núcleos con solamente pequeños fragmentos de citoplasma . Miescher demostró que estos núcleos ya no podían ser teñidos de amarillo por las soluciones de yodo, un método comúnmente utilizado en el momento de detectar el citoplasma.

Entonces vigorosamente sacudió los núcleos durante un largo período de tiempo con una mezcla de agua y éter. Esto hizo que los lípidos se disolvieran en el éter, mientras que esos núcleos, todavía unidos al citoplasma, se recogían en la interfase agua / éter. Por el contrario, los núcleos limpios sin contaminar el citoplasma fueron retenidos en la fase acuosa. Miescher filtró estos núcleos y los examinó bajo un microscopio. Se dio cuenta de que de esta manera podía obtener "núcleos completamente puros con un contorno liso, contenido homogéneo, nucléolo nítidamente definido, algo más pequeño en comparación con sus volúmenes originales".

Miescher posteriormente extrajo los núcleos aislados con soluciones alcalinas. Al agregar el carbonato de sodio muy diluido (1: 100.000) a los núcleos, notó que se hincharían significativamente y se convertirían en translúcidos. Miescher entonces aisló una "solución amarilla de una sustancia" de estos núcleos. Al agregar ácido acético o ácido clorhídrico en exceso, podría obtener un precipitado insoluble, floculante (ADN). Miescher señaló que podría disolver el precipitado nuevamente añadiendo soluciones alcalinas.

Aunque este metodo permitió a Miescher por primera vez aislar la nucleina en una pureza y cantidades apreciables, todavía era demasiado pequeño y no lo suficientemente puro para sus análisis posteriores. Por consiguiente, mejoró este metodo hasta que estableció un nuevo metodo, que le permitió purificar cantidades suficientes de nucleina para su primer conjunto de experimentos sobre su composición elemental.

La caracterización inicial de ADN de Miescher.

Mediante la elaboración de las condiciones de aislamiento, Miescher se dio cuenta de que a pesar de tener propiedades similares a las proteínas, la nueva sustancia no era una proteína. El 26 de febrero de 1869 informó del descubrimiento de esta sustancia misteriosa en una carta a Wilhelm His : "En mis experimentos con líquidos alcalinos bajos, se formaron precipitados en las soluciones después de la neutralización que no podían disolverse en agua, Ácido acético, ácido clorhídrico altamente diluido o en una solución salina y por lo tanto no pertenecen a ningún tipo conocido de proteína ". Debido a su presencia en los núcleos, Miescher denominó el compuesto enigmático" nucleina ".

Miescher estaba intrigado por las propiedades de su nueva sustancia. Sin embargo, su primer metodo no proporcionó suficiente material para realizar un análisis posterior. Él escribió: "La cantidad mínima de núcleos que se pueden obtener mediante el procedimiento descrito  apenas permite las pocas reacciones mencionadas. Los análisis elementales ,uno de los pocos métodos disponibles para analizar sustancias nuevas en el momento, no podían ni siquiera ser considerados” . De este modo, Miescher tuvo que desarrollar un segundo metodo para obtener mayores cantidades de nucleina purificada .

Nuevo metodo.

Una preocupación clave de Miescher era deshacerse de las proteínas contaminantes, lo que habría sesgado sus análisis de la sustancia nueva. "Por lo tanto, me dirigí a un agente que ya estaba siendo utilizado en química con moléculas de albúmina a causa de su fuerte acción de disolución de proteínas, a saber, soluciones de pepsina" . La pepsina es una enzima proteolítica presente en el estómago para digerir proteínas. Miescher lo usó para separar el ADN de las proteínas del citoplasma de las células. Extrajo la pepsina para sus experimentos de estómagos de cerdo lavando los estómagos con una mezcla de 10 cc de ácido clorhídrico fumante y un litro de agua y filtrando la solución resultante hasta que quedó despejada.

En contraste con su metodo anterior, Miescher primero lavó las células de pus (leucocitos) tres o cuatro veces con "alcohol caliente" para eliminar los lípidos. Luego dejó que el material residual se digiriese con la solución de pepsina entre 18 y 24 horas a una temperatura de 37 a 45 ° C. Después de unas pocas horas, un fino sedimento pulverulento gris de núcleos aislados se separó de un "líquido amarillo". Miescher continuó el proceso de digestión, cambiando la solución de pepsina dos veces. Después de este procedimiento, se formó un precipitado de núcleos sin ningún citoplasma unido. Sacudió el sedimento varias veces con éter para eliminar los lípidos restantes. Posteriormente, filtró los núcleos y los lavó con agua hasta que ya no había ningún rastro de proteínas.

Describió los núcleos aislados de esta manera como "completamente desnudos. Los contornos eran lisos en algunos casos o ligeramente comidos en otros . Miescher lavó los núcleos nuevamente varias veces con alcohol caliente y observó que la "masa nuclear" limpiada de esta manera exhibía el mismo comportamiento químico que los núcleos aislados con ácido clorhídrico.

Miescher posteriormente extrajo los núcleos aislados usando el mismo metodo de extracción alcalina que había empleado previamente en las células intactas y al añadir un exceso de ácido acético o ácido clorhídrico a la solución, de nuevo obtuvo un precipitado de nucleina.

Con su segundo metodo, Miescher había demostrado que la nucleina no es digerida por la proteasa pepsina y determinó una vez más que podía disolver el precipitado añadiendo una base y hacer que se reprecipitase añadiendo un exceso de ácido. Después de estos ensayos sobre la solubilidad y digestibilidad de la nucleina, Miescher se enfocó en determinar su composición y se dio cuenta de que era diferente de las proteínas de otras formas también.

Quemó el precipitado y confirmó la presencia de diversos elementos comúnmente encontrados en moléculas orgánicas-carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno- a través de las reacciones químicas que exhibieron. Estas pruebas demostraron que la nucleina, a diferencia de las proteínas, carecía de azufre, pero contenía una gran cantidad de fósforo, lo que informó por primera vez en una carta a sus padres fechada el 21 de agosto de 1869 .

Basándose en sus análisis, Miescher señaló que la sustancia nueva que había aislado era diferente de los tipos conocidos de proteína . Continuó diciendo: "Creo que los análisis dados, por incompletos que sean, demuestran que no estamos trabajando con una mezcla aleatoria, sino con un individuo químico o una mezcla de entidades muy estrechamente relacionadas". Para Miescher, La gran cantidad de fósforo en la nucleina era otra indicación de que no podía ser una proteína o cualquier otra molécula conocida. Concluyó: "Estamos tratando con una entidad sui generis no comparable a cualquier grupo hasta ahora conocido" .

Después de estos experimentos con leucocitos, Miescher también descubrió la presencia de nucleina en las células de otros tejidos . Sospechaba que, tras una investigación más profunda, se revelaría una "familia entera de tales sustancias que contienen fósforo, que difieren ligeramente unas de otras, y que esta familia de cuerpos de nucleinas demostrará tener importancia para las proteínas" .

Sin saber nada sobre cómo funciona la nucleina, Miescher sin embargo asumió que juegan un papel central en las células.

Lenta aceptación de la nucleina

Miescher trabajó y descubrió que los espermatozoides demostraron ser un material fuente ideal para el aislamiento de grandes cantidades de nucleina muy pura. Miescher eligió estas células debido a su composición simple con sus cabezas compuestas casi exclusivamente de un núcleo. Por último, vio la posibilidad de obtener suficientes cantidades de nucleina para realizar los exhaustivos experimentos cuantitativos.

La ubicación de Basilea en el río Rin con su migración anual de aguas arriba del salmón hacia sus zonas de desove tenía una floreciente industria de la pesca del salmón y había una abundancia de salmón recién capturado a disposición de Miescher. Así, en el otoño de 1871, comenzó a trabajar en espermatozoides de salmón y desarrolló numerosos metodos cada vez más sofisticados para el aislamiento de la nucleina .

La siguiente foto es un frasco de vidrio que contiene nucleina aislada del esperma de salmón por Friedrich Miescher mientras trabajaba en la Universidad de Basilea.

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Nucleic Acids

Discovering DNA: Friedrich Miescher and the early years of nucleic acid research



Cell Fractionation

Isolation of Cell Organelles - Subcellular Fractionation

Eduardo Ghershman, 30.5.2017